MAKALAH ANALISIS FISIKO KIMIA
“Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT / HPLC) ”
Disusun oleh :
Rinto Aditya / D1A141029
Perihal :
Untuk memenuhi tugas
makalah ANFISKO
FAKULTAS MATEMATIKA DAN
ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN FARMASI
UNIVERSITAS AL-GHIFARI
BANDUNG
2015
BAB I
Pendahuluan
1.1 Latar
belakang
Kromatografi adalah istilah umum untuk
berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fasa yang bergerak,
dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat
padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada
tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan
pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk
menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom. Kromatografi
merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu
lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan
cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner
mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu
cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi
menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.
Pembahasan teknik kromatografi
modern, baru lengkap bila disebut
kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom
klasik merupakan prosedur pemisahan yang
sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom
karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah
dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian
dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena
dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja
pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan
kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju
alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan
jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan
yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal,
HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organic.
1.2 Tujuan
a)
Mengetahui
Pengertian HPLC
b)
Mengetahui
Jenis- jenis HPLC
c)
Mengetahui
Hukum yang mendasari Prinsip kerja HPLC
d)
Mengetahui
Komponen alat dan kegunaan
e)
Mengetahui
Gambar bagan alat dan keterangan komponen-komponen alat
f)
Mengetahui
Kelebihan dan Kekurangan HPLC
g)
Mengetahui
contoh proses penelitian dibidang farmasi yang menggunakan instrument HPLC
BAB II
Pembahasan
2.1 Pengertian
HPLC
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT)
atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif dan kuantitatif. HPLC secara mendasar merupakan sebuah perkembangan
tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes
melalui kolom di bawah pengaruh gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang dapat
memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat
memisahkan komponen sampel lebih cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel dalam berbagai bidang, antara lain : farmasi,
lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. Beberapa
perkembangan HPLC terbaru antara lain : miniaturisasi sistem HPLC, penggunaan
HPLC untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat,
dan analisis senyawa-senyawa kiral.
2.2 Jenis-
jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan
dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase
geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding
dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC
dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain
klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase
diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC
sebagai berikut:
2.2.1 Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah
diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis.
Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90%
kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina
terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada
silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara
kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
2.2.2 Kromatografi Fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini
adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini
yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon
non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase
diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan
kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran
metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang
bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena
kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase
diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak
terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih
cepat.
2.2.3 Kromatografi Penukar ion
HPLC penukar ion menggunakan fase diam
yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak
penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas
penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion
dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa
hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik.
Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh
kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar
garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh
penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus
penukar ion pada resin.
2.2.4 Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat
digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah
yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang
mempunyai muatan yang berlawanan.
2.2.5 Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan
kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau
menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang
digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut
dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam.
Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih
dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah
molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar
tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan
demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi
kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
2.2.6 Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi
karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam
mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada
kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang
sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi
jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang
sangat kompleks.
2.3 Hukum
yang mendasari Prinsip kerja HPLC
Kerja HPLC pada prinsipnya
adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari
kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang
paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan
tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu
retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas: golongan
fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan
eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol <
golongan asam.
HPLC dapat menganalisa secara
kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang paling umum untuk
mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai
RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analit. Selain
melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal
kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga
jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga
dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama. Kemudian
melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di
dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah
kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom
C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan
sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa
tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan
untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses
separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil
dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC
diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat
peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample. Sample yang
mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak
peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan
menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu
biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih
rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.
Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen
selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
2.4 Komponen
alat dan kegunaan
Instrumentasi HPLC pada dasarnya
terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir), pompa, alat untuk memasukkan
sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak,
dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem
kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :
2.4.1 Wadah fase gerak (Reservoir)
Wadah fase gerak harus bersih dan
lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan
sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara
1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan
deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam
fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis.
Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan
resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih
polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya
polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar
daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas
pelarut.
1)
Fase Gerak
Fase gerak dalam
HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain
berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector,
fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu,
fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan
proses pemisahan.
2)
Persyaratan
fase gerak HPLC:
o Zat cair harus
bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
o Zat cair harus
murni sekali untuk menghindarkan masuknya
o Kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatografi.
o Zat air
harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
o Zat cair harus
mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
o Zat air tidak
kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
o Sesuai dengan
detector.
3)
Jenis HPLC berdasarkan
kepolaran fase diam dan fase gerak:
o
HPLC
fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan
fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica,
alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan
fase gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.
o
HPLC
fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan
fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol,
atau asetinitril.
Fase gerak yang baik memberikan
factor kapasitas k’ pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3
komponen, sebaiknya menggunakan fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5.
2.4.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan
untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah
pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai
untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang
digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase
gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa
dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran
fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan
sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
1)
Pompa
reciprocating
Pompa ini terdiri
dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston
mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak
langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat
dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup
saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke
dalam kolom.
2)
Pompa
displacement
Pompa ini menyerupai
syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang
digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak
bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
3)
Pompa pneumatic
Dalam pompa ini
pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas
pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan
(<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan
takanan balik kolom.
2.4.3 Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian
ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel
yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual
melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop
dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL).
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
1)
Stop-Flow
Aliran dihentikan,
injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil
clan resolusi tidak dipengaruhi
2)
Septum
Septum yang digunakan
pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat
digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan
dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang
terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
3)
Loop Valve
Tipe injektor ini
umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan
dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang
lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi
kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan
masuk ke dalam kolom.
Syarat- syarat injektor yang
baik :
1)
Dapat
memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
2)
Mudah digunakan
3)
Keberulangan
tinggi
4)
Dapat bekerja
walaupun ada tekanan balik
2.4.4 Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu
kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang
mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solute / analit. Kolom
mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,
yakni:
1)
Konsumsi fase
gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat
(10 -100 μl/menit).
2)
Adanya aliran
fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung
dengan spektrometer massa.
3)
Sensitivitas
kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini
sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian,
dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan
kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
v Fase Diam
Kebanyakan
fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika
yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.
Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus
silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan
reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil
silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.
Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang
polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai
pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan
memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air
yang digunakan.
2.4.5 Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan
menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara
umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,
seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya,
suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
1)
Mempunyai
respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
2)
Mempunyai
sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat
kecil;
3)
Stabil dalam
pengopersiannya;
4)
Mempunyai sel volume
yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;
5)
Signal yang
dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier);
6)
Tidak peka
terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Karakteristik detector HPLC:
Gambar bagan
alat dan keterangan komponen-komponen alat
2.5 Kelebihan
dan Kekurangan HPLC
2.5.1 Kelebihan High Performance Liquid
Chromatografi:
o
Isolasi zat
yang tidak mudah menguap (non volatile)
o
Isolasi zat
yang secara termal tidak stabil
o
Dapat
diopersikan pada suhu kamar
o
Mampu
memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
o
Sudah digital
sehingga penggunaannya cepat, mudah dan lebih praktis
o
Kecepatan
analisis dan kepekaan yang tinggi
o
Dapat dihindari
terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
o
Resolusi yang
baik
o
Dapat digunakan
bermacam-macam detector
o
Kolom dapat
digunakan kembali
o
Mudah melakukan
"sample recovery"
2.5.2 Kekurangan High Performance Liquid
Chromatografi:
o
Larutan harus
dicari fase diamnya terlebih dulu
o
Hanya bisa
digunakan untuk asam organic
o Harus
mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi
o Harganya mahal
sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
2.6 Contoh
proses penelitian dibidang farmasi yang menggunakan instrument HPLC
Metode KCKT merupakan metode yang
sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan
atau dalam sampel hayati .Hal ini disebabkan KCKT merupakan metode yang
memberikan sensitifitas dan spesifitas yang tinggi. Berikut ini adalah
beberapa contoh penggunaan KCKT untuk analisis beberapa sediaan farmasi :
2.6.1 Parasetamol
Nama Kimia : 4- Hidroksiasetanilida
Rumus Molekul : C8H9NO2
Berat Molekul : 151,16
Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit
pahit.
Kelarutan : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut dalam etanol.
(Depkes RI, 1995).
Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol
atau asetaminofen merupakan derivat para-amino fenol yang berkhasiat sebagai
analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan pengganti yang baik untuk
analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan saluran cerna
dan pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak menguntungkan.
Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis.
Parasetamol adalah senyawa yang
memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa
ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis
dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar
seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran
cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh
plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25%
parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan
antipiretik.
Pengujian kadar parasetamol dalam obat
menggunakan teknik HPLC , dalam proses analisisnya HPLC memiliki beberapa
tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji yaitu larutan obat yang
sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom HPLC dengan
injektor khusus / syringe yang bervolume 20 µL, penyaringan sebelum
penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan
menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom
dengan bantuan pompa bertekanan tinggi. Di dalam kolom, komponen- komponen pada
sampel dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap
fasa diamnya. Solut yang interaksinya kurang kuat akan keluar lebih lambat dari
kolom daripada solut lainnya. Komponen akan keluar dari kolom dengan kecepatan
yang berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan adalah
detektor UV karena parasetamol merupakan senyawa organik yang dapat menyerap
sinar UV. Pengujian ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan
panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm. Teknik yang
dilakukan kali ini merupakan “reverse phase” atau fasa terbalik karena teknik
ini menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa diamnya
menggunakan pelarut non- polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam yang
berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa
diamnya saat melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki
jangka waktu yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan
sampel untuk melewati kolom ini disebut waktu retensi. Dalam pengujian
parasetamol dalam obat, waktu retensi yang terukur adalah antara 2,19 hingga
2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu citra berupa
kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara intensitas komponen yang
dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Seharusnya tampilan kromatogram
ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang diperoleh pada
percobaan ini sedikit melebar dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan
antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC, difusi yang terjadi adalah
difusi longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu sendiri
disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer
massa disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak merata. Terdapat beberapa
parameter pemisahan dalam HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/
menit, ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran partikel analit, dan
laju difusi yang sudah disebutkan diatas. Parameter- parameter ini dapat
menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti pelebaran pada
puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan terjadinya
overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju
difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin sulit dipisahkan secara
efisien. Dari grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar
parasetamol dalam sampel obat. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari
sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh kadar parasetamol sebesar 83,444 %
sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar 738,2 mg diperoleh massa
parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg. Dapat disimpulkan bahwa
kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg per tabletnya.
2.6.2 Kafein
Rumus struktur :
Nama Kimia : 1,3,7-Trimetil xantin
Rumus Molekul : C8H10N4O2
Berat Molekul : 194,19
Pemerian : Serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat
putih, biasanya menggumpal, tidak berbau, rasa pahit.
Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah
larut dalam kloroform, sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).
Dalam penetapan kandungan kafein
digunakan sampel berupa minuman berkafein. HPLC yang digunakan adalh jenis HPLC
Series 200 dengan detector 275 nm Perkin Elmer, Kolom : Supelcosil LC : 18, (
25 cm X 4,6mm, 5 μm ). Menggunakan asam asetat 70% dan methanol 30% sebagai
fasa gerak. Proses pengerjaan terdiri dari 2 tahap, yaitu tahap preparasi dan tahap
injection ke HPLC.
Bab
III
Penutup
3.1 Kesimpulan
1)
HPLC adalah
singkatan dari High Performance Liquid Cromatography, yaitu alat yang berfungsi
mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan
partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan
(fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara mendasar
merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.
2)
Prinsip dasar
dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya sedangkan
prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji
diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan
terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan kepolaran
afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
(spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang
tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh
recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggungakan integrator atau
menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC
tersebut.
3)
Keuntungan dari
penggunaan HPLC yaitu :
o
Lebih teliti
o
Sudah digital
sehingga penggunaannya cepat dan lebih praktis
o
Mampu
memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
o
Mudah
melaksanakannya
o
Kecepatan
analisis dan kepekaan yang tinggi
o
Dapat dihindari
terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
o
Resolusi yang
baik
o
Dapat digunakan
bermacam-macam detector
o
Kolom dapat
digunakan kembali
o
Mudah melakukan
"sample recovery"
4)
Kerugian dari
penggunaan HPLC yaitu :
o
Larutan harus
dicari fase diamnya terlebih dulu
o
Hanya bisa
digunakan untuk asam organic
o
Harus
mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi.
o
Harganya mahal
sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
Daftar Pustaka
(http://materi-kimia-lengkap.blogspot.co.id/2014/07/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-kckt.html?m) (diakses 3 desember 2015)
(http://putrawan-bachriul999.blogspot.co.id/2012/05/hplc.html?m=1) (diakses 4 desember 2015)
o
Eka Andrian.
2013. HPLC.
(http://ekaandrians.blogspot.co.id/2013/04/hplc.html?m=1) (diakses 5 desember 2015)
Tidak ada komentar:
Posting Komentar